MDCK细胞无血清培养基

简要描述:
MDCK细胞无血清培养基用于MDCK细胞的传代培养。 在整个细胞培养过程中,不需添加血清或替代物。 MDCK细胞可直接转入MDCK细胞无血清培养基培养,不需要经过血清浓度逐步降低的细胞驯化过程。

产品描述

MDCK细胞无血清培养基

 【MDCK细胞无血清培养基   用途与描述】

MDCK细胞无血清培养基是一款专门用于培养MDCK细胞的无血清培养基。

MDCK细胞无血清培养基中不含胎牛血清成分,细胞培养过程中也不需要添加任何血清,无血清培养的MDCK细胞可达到完全培养基
(DMEM+10%FBS)培养的状态,连续传代50代,细胞特性无改变,生长速率优于完全培养基。MDCK细胞的倍增时间小于20小时。

MDCK细胞无血清培养基化学成分限定,在流感病毒分离中能排除血清中类淀粉蛋白P等物质对病毒吸附的影响,同时,细胞可以直接
转入无血清培养基中培养,不需要经过血清浓度逐步降低的驯化过程,能极大的帮助疾控、高校和科研院所的工作人员提高实验进度。

【MDCK细胞无血清培养基   规格与保存】

产品货号
产品名称
产品规格
保存条件
有限期限
NC0201 MDCK细胞无血清培养基 500mL/瓶 2-8℃保存 12个月

【MDCK细胞无血清培养基   使用方法】

MDCK细胞无血清培养基的使用方法跟完全培养基(DMEM+10%FBS)的相同。
不经过血清驯化的MDCK细胞,前5代左右(与MDCK细胞的初始状态有关)状态可能会稍差。

1、MDCK细胞复苏

1)从液氮罐中取出冻存管迅速置于37℃水浴锅中,使管中的液体在1min内融化。

2)在超净工作台中用无菌吸管吸取10mL预温的MDCK无血清培养基到15mL离心管中,冻存管用75%酒精擦拭表面后,将细胞悬液加入
15mL离心管中,吹吸混匀。

3)800rpm离心3min,去除上清液,用6mL预温的无血清培养基重悬细胞,接种于T25细胞培养瓶中,接种细胞密度为5×105cells/mL。

4) 37℃,5%CO2 培养箱中培养,次日更换一次培养液,继续培养1-2天至细胞铺满瓶底的80%-90%进行传代。

2、MDCK细胞传代(以T25瓶为例)

1)处于对数生长期的细胞长至融合度达到80%-90%时,弃去培养液,用PBS或不含钙镁的Hank's液清洗细胞3遍。

2)加入1mL基因重组胰蛋白酶,37℃,5%CO2培养箱中消化至细胞收缩变圆,轻拍培养瓶,镜下可观察到细胞移动加入培养基终止消化。

3)如果以1:6比例传代,加入35mL MDCK细胞无血清培养基。如果以1:4比例传代,需加25mL MDCK细胞无血清培养基。

4)分瓶后,置于37℃,5% CO2培养箱中培养,细胞长满瓶底80%-90%后进行下一次传代(一般2-3天传代一次)。

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MDCK无血清培养基使用SOP(离心).jpg

3、流感病毒的分离与培养

1) 选取融合度90%-100%且处于对数生长期的MDCK细胞,弃去培养液,用PBS或不含钙镁的Hank’s液清洗细胞2-3遍。

2)加入200 μL的流感病毒样本,温和摇动数次。

3)置于37℃,5% CO 培养箱中吸附1-2小时。

4)吸出接种物,加入6 mL流感病毒分离无血清培养基(使用前需要添加抗生素及终浓度为2ug/mL的TPCK-胰酶)于培养瓶中,放置
于33℃-35℃,5%CO2 培养箱中培养,每日观察病变。

5)当75%-100%的细胞出现病变时即可准备收获病毒。

6)温和摇动细胞瓶2-3次。将培养瓶中的病毒液置于15mL离心管中。

7)为了提高病毒滴度,可将离心管置于-70度冰箱或液氮上方反复冻融一到两次。

8)收获的病毒液可立即进行血凝试验,或负80度冰箱冷冻长期保存。

4、MDCK细胞冻存

1)选取融合度达80%-90%且处于对数生长期的MDCK细胞用于冻存。

2)依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数,800rpm离心3min。

3)去除上清液,加入商品化的细胞冻存液(冻存液需要提前预冷),冻存液中细胞的最终密度为5×106 cells/mL。用吸管轻轻吹打使
细胞混匀,然后分装至无菌冻存管中,每支冻存管加液1mL。

4)细胞经过程序降温后置于液氮中保存。(如用yocon无血清冻存液,无需程序降温,直接-80℃冻存,12h后存入液氮,长期保存。)

【MDCK细胞培养操作视频】

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乐山版《MDCK细胞复苏》
乐山版《MDCK细胞传代》
乐山版《MDCK细胞接毒》
乐山版《MDCK细胞冻存》

【MDCK细胞在MDCK细胞无血清培养基中的状态】

MDCK细胞在无血清培养基中传代第10代.jpg MDCK细胞在无血清培养基中传代第20代.jpg MDCK细胞在无血清培养基中传代第30代.jpg MDCK细胞在无血清培养基中传代第32代.jpg
MDCK细胞在无血清培养基
中传代第10代
MDCK细胞在无血清培养基
中传代第20代
MDCK细胞在无血清培养基
中传代第30代
MDCK细胞在无血清培养基
中传代第32代

客户问答

1、 用MDCK细胞无血清培养基+流感病毒分离无血清培养基与传统的DMEM+10%胎牛血清培养细胞相比,病毒侵染时间相同吗?

答:无血清培养基培养的MDCK细胞,病毒侵染和释放都较快,病变进程迅速,请及时根据病变程度收获病毒。

2、 MDCK细胞无血清培养基中含抗生素吗?

答:MDCK细胞无血清培养基中未添加抗生素,建议使用前添加青链霉素溶液(青霉素终浓度为100U/mL,链霉素终浓度为100μg /mL)
特别提醒:加入青链霉素的培养基,青链霉素活性会降解,2-8度保存条件下使用期限不超过三个月。

3、 MDCK细胞扩瓶比例应该是多少?

答:MDCK细胞无血清培养基培养的MDCK细胞扩瓶比例不宜过高,建议不超过1:6,否则可能会出现细胞生长缓慢的情况。使用的MDCK细胞代数不宜超过25代,代数过高会出现细胞生长快,对病毒不敏感等情况,建议更换细胞株。

4、 需要向MDCK细胞无血清培养基中添加L-谷氨酰胺吗?需要调节pH值吗?

答:MDCK细胞无血清培养基开瓶即能使用,不需要添加L-谷氨酰胺和调节pH值。

5、 无血清培养基培养的MDCK细胞在传代时,终止消化后必须要离心吗?我们实验室没有离心机怎么办?

答:终止消化后,我们建议通过离心去除EDTA-胰酶,防止EDTA-胰酶使细胞出现空泡化或其他生长衰退的情况。
不过您没有离心机也没关系,我们有不离心的SOP供您借鉴。
特别提醒:MDCK细胞无血清培养时,禁止消化过度,过度消化会对细胞膜造成损伤,导致后期传代细胞状态变差,细胞边缘不清晰,胞间黑点增多,甚至有可能随着传代次数增多,细胞贴壁不紧,甚至细胞飘起,后期无法继续培养。

MDCK无血清培养传代-不离心jpg

MDCK无血清培养传代过程-离心.jpg

使用说明

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背景知识

2015年4月1日,乐山生物MDCK细胞无血清培养基产品正式推向市场。我公司为国内首先推出该产品的企业,该产品已获国家发明专利。

MDCK细胞,中文称之为犬肾细胞,由于其有着良好的性能,因此多在流感病毒分离中作为宿主细胞使用。MDCK无血清培养基,顾名思义,就是使用中不需要添加血清,生产培养基时也没有添加血清的培养基产品。实际上是相对于完全培养基而言的,所谓的完全培养基,就是指DMEM+10%血清。MDCK无血清细胞培养基产品用于MDCK细胞的传代与培养,可以完全替代原有的DMEM+10%血清的使用方法。

作为一家成立9年的企业,也是一家深耕疾控系统9年的企业,我们或许比其他人更能深刻的理解用户的需求。MDCK细胞,作为中国各级疾控系统用于流感病毒分离的宿主细胞,在全国流感监测网络中的病毒分离工作中起着基础的作用。常规的DMEM+10%血清的培养MDCK的方法,存z在几个不便:一是使用不便。血清需要-20度保存,因此每次使用需要先融化血清。而培养基仅需要4度保存。因此,每次细胞培养总要经历令人心烦的等待过程;二是效果不稳定。血清是公认的批间差极大的产品。所以很多人干脆适应了一下子订购同一批号的很多血清,一直用到失效扔掉。也不愿意同时使用2个批号的产品,因此批间差太大了。而无血清培养基恰恰没有这两个问题:一是保存温度4度,即用即取,不需等待;一是批间差稳定,因为培养基的组份均为化学成分确定的稳定物质,想有批间差也难。

我公司在深刻理解客户需求的基础上,开发出了这款为疾控客户量身定制的产品:
在产品使用方面:与原有使用方法完全一致,不需进行任何培训;
在细胞形态方面:与完全培养基培养的细胞形态一致,没有重新适应细胞形态的担心;
在传代次数方面:可从2代稳定的传导50代以上,被病毒侵染能力未见下降。
在使用便利方面:不需要进行细胞驯化,直接将冻存的细胞放入其中复苏即可使用。

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